Dal nativo Wisconsin, Mark Ruffalo si trasferì assieme alla famiglia a Virginia Beach, in Virginia, dove trascorse l'adolescenza. Dopo che Mark ebbe finito il liceo, i Ruffalo si spostarono nuovamente, stavolta in California, prima a San Diego e poi a Los Angeles. Iniziò a seguire i corsi dello Stella Adler Conservatory e in seguito fu co-fondatore della Orpheus Theatre Company, per cui fu factotum: recitava, scriveva, dirigeva e produceva, oltre a occuparsi delle luci e delle scenografie.
Nonostante le ottime recensioni dei suoi lavori teatrali, non ebbe proposte per TV e cinema e fu costretto a fare il barista per quasi nove anni per sbarcare il lunario. Proprio quando stava per arrendersi, incontrò il drammaturgo e sceneggiatore Kenneth Lonergan, e riscosse un enorme successo a New York recitando nel suo dramma "This Is Our Youth", grazie al quale ottenne anche il ruolo principale nel film Conta su di me (2000), sempre di Lonergan. L'incredibile interpretazione accanto a Laura Linney aprì gli occhi dell'establishment sul suo grande talento: qualcuno arrivò a paragonarlo persino al giovane Marlon Brando. Nello stesso anno si è sposato con l'attrice Sunrise Coigney, con la quale ha messo al mondo tre bambini, Keen, Bella Noche, e Odette.
Sfortunatamente, il destino si mise di nuovo contro la carriera di Ruffalo. Proprio quando l'attore era stato reclutato per recitare in Signs di M. Night Shyamalan, infatti, gli venne diagnosticato un tumore al cervello, che gli procurò anche una temporanea semiparalisi facciale. Grazie al cielo Mark è riuscito a riprendersi in breve tempo e a ha potuto continuare la sua scalata al successo, cominciando ad apparire in uno svariato numero di produzioni, tra cui alcuni ruoli secondari nel bellico Windtalkers e nella la commedia Una hostess tra le nuvole, cui seguirono il thriller In the Cut, di Jane Campion, dove è un detective che innesca una torbida relazione con l'insegnante Meg Ryan e la spensierata commedia fantastica 30 anni in un secondo, in cui si innamora della "tredicenne" Jennifer Garner.
Nel capolavoro Se mi lasci ti cancello di Michel Gondry è un tecnico addetto alla cancellazione dei ricordi, mentre nel serrato noir Collateral di Michael Mann è un poliziotto sulle tracce dell'assassino Tom Cruise.
Oramai divenuto un interprete affermato, Ruffalo è in grado di passare con scioltezza dalle commedie romantiche Se solo fosse vero, dove intreccia una relazione nientemeno che con una Reese Witherspoon in versione fantasmatica, e Vizi di famiglia, in cui cerca di convincere Jennifer Aniston a sposarlo, ai noir Tutti gli uomini del re, dove attenta alla vita del potente governatore Sean Penn e Zodiac, nel quale è il detective che si mette sulle tracce del pericoloso serial killer di San Francisco.
Non si sono fatti attendere ruoli più complessi e sfaccettati, come quelli nello straziante Reservation Road di Terry George, dove è un uomo distrutto dal senso di colpa per aver investito un bambino, e nell'intricato thriller Shutter Island di Martin Scorsese, dove è il poliziotto compagno del protagonista Leonardo DiCaprio.
Dopo un piccolo ruolo nella oscura favola Nel paese delle creature selvagge di Spike Jonze, e nella rutilante commedia Notte folle a Manhattan, insieme a Steve Carell e Tina Fey, l'attore ha regalato una delle sue migliori interpretazioni nell'esilarante I ragazzi stanno bene di Lisa Cholodenko, dove impersona lo svogliato "papà in vitro" di due ragazzi messi al mondo con la fecondazione assistita dalla coppia lesbica Annette Bening - Julianne Moore: un ruolo brillante che gli è valso una nomination all'Oscar.
Nonostante il successo hollywoodiano, Mark è rimasto fedele alle sue radici teatrali e collabora con una piccola compagnia losangelina, recitando e dirigendo occasionalmente, tra un ruolo cinematografico e l'altro: ruoli sia da protagonista che secondari in cui ha continuato a dare prova di bravura e versatilità. Non contento, inoltre, nel 2010 si è cimentato anche dietro la macchina da presa con il dramma Sympathy for Delicious, incentrato su un ragazzo paralizzato, che ha vinto il premio della giuria al Sundance Film Festival.
2024 Candidatura Miglior Attore non Protagonista (Oscar 2024) per Povere Creature!
2016 Candidatura Migliore attore non protagonista per Il caso Spotlight
2015 Candidatura Migliore attore non protagonista per Foxcatcher - Una storia americana
2011 Candidatura Migliore attore non protagonista per I ragazzi stanno bene
2016 Candidatura Migliore attore protagonista (commedia o musical) per Teneramente Folle
2015 Candidatura Miglior attore non protagonista per Foxcatcher - Una storia americana
2015 Candidatura Miglior attore (Miniserie o film per la tv) per The Normal Heart
2016 Candidatura Migliore attore non protagonista per Il caso Spotlight
2015 Candidatura Migliore attore non protagonista per Foxcatcher - Una storia americana
2011 Candidatura Migliore attore non protagonista per I ragazzi stanno bene
2019 Produzione, Recitazione
2019 Recitazione
2017 Recitazione
2016 Recitazione
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