James nasce a Greenville, ma si trasferisce in tenera età a Modesto, in California. Il padre è un ministro metodista e la madre lavora come assistente sociale. Ha una sorella maggiore, Susan, e un fratello minore, Paul. Già da bambino sogna di diventare un attore e muove i primi passi sulla scena in Winnie the Pooh e altri musical alla Davis High School. Dopo il diploma si iscrive alla Pacific Conservatory of the Performing Arts, studia all'American Conservatory Theatre e nel 1982 entra alla prestigiosa Juliard Drama School, dalla quale però viene espulso due anni dopo.
Inizia la sua carriera recitando in piccoli ruoli teatrali a New York.
Nel 1987 si sposta a Chicago, dove ottiene la prima scrittura di rilievo al Goodman Theatre, ne La Tempesta di Shakespeare, nel ruolo di Ferdinando. Sempre a Chicago diventa co-fondatore del New Mercury Theatre (in onore del Mercury Theatre di Orson Welles), ma nel 1990 la compagnia si trasferisce a Seattle in cerca di maggiori opportunità. Qui James recita per molti anni al Mercury e in altri teatri; la sua tragedia preferita è il Macbeth e il suo sogno più grande è di dirigere un film basato sull'opera Shakespeariana.
Si sposa con Liane Davidson e nel 1996 danno alla luce Sullivan. Dopo qualche tempo il matrimonio finisce e James ottiene l'affidamento congiunto del figlio. Insieme al bambino, James ha in affidamento anche Brittany, figlia del fratello Paul, nata lo stesso anno di Sullivan.
Nel 1992 copre piccoli ruoli nelle serie tv Un medico fra gli orsi e Andromeda e comincia a entrare nel mondo del cinema con un ruolo nel film Chance.
Il New Mercury cerca in tutti i modi di ottenere risultati, spesso recitando in posti di fortuna, come chiese e cantine di ristoranti; tuttavia James decide alla fine di tentare altre strade, partendo alla volta di Hollywood su suggerimento di amici e colleghi.
Partecipa all'audizione per la serie che gli cambierà la vita Buffy, l'Ammazzavampiri, nella quale ottiene il ruolo di Spike, il vampiro biondo (modellato sulla figura del cantante pop-punk Billy Idol) che dà il tormento alla Cacciatrice (Sarah Michelle Gellar). Il personaggio è inizialmente destinato a durare poco, ma il creatore della serie Joss Whedon rimane colpito dall'interpretazione di James e dal successo riscosso sul pubblico, decidendo così di prolungare la vita del non-morto Spike, facendogli anche intraprendere una tormentata relazione con il personaggio di Buffy.
James rimane nello show per i successivi sette anni, divenendo membro fisso del cast. I fan lo idolatrano e creano un vero e proprio fenomeno di culto con centinaia di siti dedicati al bel vampiro anarchico e biondo.
Tuttavia, James non rimane sugli allori e continua a cercare altri personaggi da interpretare: nel 1998 ricopre un ruolo importante nell'opera indipendente Winding Roads, mentre l'anno seguente recita nel film horror Il mistero della casa sulla collina.
Nel 2002 fonda la band Ghost of the Robot insieme agli autori di Buffy, Steve DeKnight e Doug Petrie, debuttando con l'album Mad Brilliant. Dopo due anni, però, James abbandona la band per intraprendere una carriera da solista, e il 2005 lo vede impegnato nel tour europeo per promuovere il suo primo album Civilized Man, cui due anni dopo ne è seguito un secondo, Like a Waterfall.
Nel 2004 la Royal Shakespeare Company of Stratford organizza un sondaggio chiedendo al pubblico chi vorrebbe vedere nei panni di Romeo: James ottiene il primo posto, battendo attori del calibro di Johnny Depp, Ewan McGregor, Jude Law e Orlando Bloom.
Quando non è sul set a girare, James ama suonare la sua chitarra, dipingere, guidare nel deserto e scrivere: nel 1999 realizza il fumetto Buffy, l'Ammazzavampiri: Spike & Dru insieme a Christopher Golden. Il fumetto si basa sui personaggi dell'omonima serie tv ed è prodotta dalla Dark Horse Comics.
Nel novembre del 2004 torna a recitare nel film tv Cool Money, dove interpreta Bobby Comfort, il ruolo principale. Seguono poi altre produzioni decisamente poco memorabili, come il sentimentale P.S. I Love You (dove ha un ruolo secondario), il film tv Moonshot - L'uomo sulla luna, dove impersona il mitico astronauta Buzz Aldrin; mentre nel deludente Dragonball Evolution, live action tratto dal celebre anime, si trasforma nell'alieno malvagio Piccolo.
James ha continuato decisamente a ottenere maggiori consensi nel mondo del piccolo schermo. Nella serie Smallville, dedicata alle avventure del Superman adolescente, ha impersonato il malvagio androide alieno Brainiac. Ha poi proseguito con il filone fantascientifico, prendendo parte anche ai serial Torchwood (spin-off di Doctor Who) dove è l'ambiguo viaggiatore nel tempo Captain John Hart, e Caprica (spin-off di Battlestar Galactica), in cui è il terrorista Barnabas Greeley.
2005 Candidatura Miglior attore non protagonista televisivo per Angel
2004 Premio Miglior attore non protagonista televisivo per Buffy - L'ammazzavampiri
2003 Candidatura Miglior attore non protagonista televisivo per Buffy - L'ammazzavampiri
2002 Premio Cinescape Genre Face of the Future Award - Male per Buffy - L'ammazzavampiri
2002 Candidatura Miglior attore non protagonista televisivo per Buffy - L'ammazzavampiri
2001 Premio Miglior attore non protagonista televisivo per Buffy - L'ammazzavampiri
2000 Candidatura Miglior attore non protagonista in una serie TV per Buffy - L'ammazzavampiri
2003 Candidatura Miglior attore in una serie televisiva dramma per Buffy - L'ammazzavampiri
2002 Candidatura Miglior attore in una serie televisiva dramma per Buffy - L'ammazzavampiri
2000 Candidatura Miglior 'sidekick' televisivo per Buffy - L'ammazzavampiri
2008 Recitazione
2009 Recitazione
2007 Recitazione
2005 Recitazione
James Marsters, interprete di Spike in Buffy - l'ammazzavampiri, ha svelato che Joss Whedon non voleva mostrare i vampiri in modo romantico.
James Marsters, Spike in Buffy - L'ammazzavampiri, ha descritto l'aggressione verbale di Joss Whedon nei suoi confronti in seguito al successo imprevisto del suo personaggio.
James Marsters si è detto disponibile ad interpretare nuovamente Spike nel reboot di Buffy l'ammazzavampiri.
In occasione del ventesimo anniversario della serie di culto passiamo in rassegna l'evoluzione delle carriere dei partecipanti principali, davanti e dietro la macchina da presa.
A vent'anni dal debutto americano, ricordiamo la fortunata serie con protagonista Sarah Michelle Gellar attraverso qualche curiosità e retroscena.