Nicholas Brendon nasce a Los Angeles il 12 Aprile 1971, esattamente tre minuti dopo il suo gemello, l'attore Kelly Donovan. Alla Chatsworth High School eccelle nel baseball, ma ha difficoltà con lo studio dovute ad una forma di balbuzie. Il suo sogno è di giocare per i Dodgers, una delle più famose squadre di baseball, ma purtroppo deve rinunciare a causa di un infortunio al braccio occorsogli a un anno dal diploma.
Per superare il problema della balbuzie, Nicholas decide di darsi alla recitazione, ma dopo due anni rinuncia perché "non sopporta le regole politiche di Hollywood". Decide di iscriversi al Pasadena City College, alla facoltà di medicina, ma dopo poco rinuncia. Prova una varietà di altri lavori, incluso l'idraulico, il cameriere, l'assistente produttore e il custode in un ambulatorio veterinario.
Un nuovo tentativo con il cinema avviene qualche anno dopo e già dopo due mesi ottiene il provino per il personaggio di una serie tv: lui ancora non lo sa ma sarà il ruolo della vita. Si tratta di Xander Harris nella famosa serie Buffy l'Ammazzavampiri. Lo show continua a mietere successi dal 1997 fino al 2003, regalando a Nicholas una nutrita schiera di fan che continuano a seguire i suoi progressi come parte della Scooby Gang dello show.
Il suo gemello, Kelly, interpreta insieme al fratello l'episodio Due gocce d'acqua (The Replacement (5x03), nel quale Xander si sdoppia in due entità distinte.
Nel 2000 Brendon interpreta Starcat nel film Psycho Beach Party, una satira diretta da Charles Busch e nel 2004 viene diretto da Larry Shaw nel film tv Celeste in the city. L'attore esordisce anche a teatro in varie produzioni: The Further Adventures of Tom Sawyer al Theater West, My Own Private Hollywood al Black Hole Theater, Out of gas on lover's leap al Pasadena Playhouse.
Fuori dal set, fa parte dell'Associazione Balbuzienti d'America e partecipa attivamente alle campagne informative, spesso prestando la sua immagine per le promozioni dell'associazione. È il primo membro a ricoprire il ruolo di portavoce per tre anni di seguito. Nonostante abbia dovuto rinunciare alla carriera professionistica come giocatore, ama ancora giocare a baseball e tra i suoi hobby ci sono il campeggio e il basket.
Nel 2005 partecipa a una convention di Buffy a Cleveland, dove annuncia che si è iscritto a un programma di riabilitazione per un problema di alcolismo. Sempre nel 2005 entra a far parte del cast della sitcom della Fox Kitchen Confidential, serie basata sul libro dello chef Antony Bourdain, cancellata purtroppo dopo una sola stagione.
In seguito l'attore presta la sua voce nella serie animata American Dragon: Jake Long e partecipa alla commedia teatrale Lobster Alice insieme a Noah Wyle. Recita nel film della ABC Family Chaos, dove c'è una reunion con l'ex co-star di Buffy Charisma Carpenter, interprete di Cordelia Chase.
Compare successivamente in alcuni episodi della serie CBS Criminal Minds, nel ruolo dell'analista Kevin Lynch, Senza traccia, nella parte di Edgar, e Private Practice, nel ruolo di un individuo mentalmente instabile che aggredisce Charlotte King.
Al cinema, invece, prende parte solo a piccole produzioni e film tv, non distribuite in Italia, come The Portal, A Golden Christmas e My Neighbor's Secret. Continua parallelamente a cimentarsi in spettacoli teatrali (tra cui The Santaland Diaries e Why Torture Is Wrong, And The People Who Love Them) e nel 2010 realizza un web-comic, Very Bad Koalas.
Le ultime apparizioni risalgono alla serie Nickelodeon Hollywood Heights (2012) e alla comedy Netflix Faking It (2014-2016).
Per un lungo periodo vive insieme al fratello gemello a LA, tanto da essere scambiato per lui dai fan e viceversa. Nel 2001 sposa l'attrice Tressa Di Figlia ma i due divorziano 5 anni dopo. Nel 2010 viene arrestato per un episodio di vandalismo e per aver opposto resistenza a un poliziotto. Un nuovo ricovero per disintossicazione avviene nel 2015.
Muore all'età di 54 anni, il 20 marzo 2026 a San Francisco per cause naturali.
2000 Candidatura Miglior attore non protagonista in una serie TV per Buffy - L'ammazzavampiri
1999 Candidatura Miglior attore televisivo di genere per Buffy - L'ammazzavampiri
1998 Candidatura Miglior attore televisivo di genere per Buffy - L'ammazzavampiri
2006 Recitazione
2004 Recitazione
2009 Recitazione
2007 Recitazione
Sarah Michelle Gellar, Alyson Hannigan, Emma Caulfield e il team creativo della serie soprannaturale di culto hanno omaggiato l'interprete di Xander, morto per cause naturali a 54 anni.
La famiglia, con un post su Instagram, ha confermato online che l'attore ha perso la vita nel sonno nella giornata di venerdì 20 marzo 2026.
L'attore di Buffy l'Amazzavampiri Nicholas Brendon non è decisamente un fan dello spin-off Angel e del suo interprete, David Boreanaz.
La manager di Nicholas Brendon ha recentemente parlato della paralisi genitale che ha colpito la star di Buffy l'ammazzavampiri.
Secondo quanto riportato da TMZ, Nicholas Brendon di Buffy - L'ammazzavampiri è stato arrestato per possesso di droghe.